文獻(xiàn)導(dǎo)讀

2021年5月8日，來自美國羅格斯大學(xué)羅伯特伍德約翰遜醫(yī)學(xué)院的Leonard Y Lee和Shaohua Li教授在《Autophagy》上聯(lián)合發(fā)表了題為“CREG1 promotes lysosomal biogenesis and function”的文章。

研究介紹

E1A激活基因抑制子（CREG）最初被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，后來發(fā)現(xiàn)CREG是一種可以分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的糖蛋白，分為CREG1和CREG2。CREG1對胚胎發(fā)育和正常生理至關(guān)重要，其失調(diào)與各種疾病有關(guān)，包括神經(jīng)退行性變、糖尿病和癌癥。然而，人們對CREG1在自噬中的作用知之甚少。因此，作者對其功能進(jìn)行了探討。

CREG1蛋白在脾臟、肝臟、肺、白色脂肪組織以及白細(xì)胞和骨髓中均高表達(dá)。超量表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，CREG1主要靶向于核內(nèi)質(zhì)溶酶體室。通過對LO2肝細(xì)胞中的內(nèi)源性CREG1進(jìn)行了免疫染色，作者確定CREG1是一種核內(nèi)質(zhì)溶酶體蛋白。進(jìn)一步地，作者發(fā)現(xiàn)N端糖基化是CREG1從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)-溶酶體室所必需的。為了確定小鼠胚胎發(fā)育過程中CREG1的定位，作者用CREG1抗體與核內(nèi)質(zhì)和溶酶體隔間的標(biāo)記物共免疫染色E7.5小鼠胚胎。CREG1定位于囊泡的頂端，在內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞中呈點(diǎn)狀高表達(dá)。小鼠胚胎在內(nèi)臟卵黃囊發(fā)育的后期，內(nèi)體室發(fā)育良好，由管狀和囊狀結(jié)構(gòu)組成。在E16.5內(nèi)臟卵黃囊內(nèi)，CREG1在內(nèi)胚層細(xì)胞頂端的泡狀結(jié)構(gòu)中高水平表達(dá)。內(nèi)臟內(nèi)胚層主要參與營養(yǎng)吸收和降解，為胎兒提供氨基酸和其他營養(yǎng)物質(zhì)。為了完成這些功能，內(nèi)臟內(nèi)胚層細(xì)胞在頂端形成大量突出的空泡(包含溶酶體蛋白)，并通過大胞吞作用和其他形式的內(nèi)吞作用，積極內(nèi)化母體免疫球蛋白。因此，作者對內(nèi)臟卵黃囊共進(jìn)行了CREG1和IgG的免疫染色，并觀察到IgG與CREG1在內(nèi)胚層細(xì)胞頂端共定位，CREG1也與溶酶體膜蛋白LAMP2共定位于內(nèi)臟內(nèi)胚層的基底側(cè)。這表明，CREG1可能在胞吞作用以及內(nèi)體分選和轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用。

為了確定CREG1是否參與肝細(xì)胞的大胞吞作用和其他形式的內(nèi)吞作用，作者將人CREG1和控制載體分別和人干細(xì)胞LO2轉(zhuǎn)染并在示蹤劑TRITIC-dextran中孵化。結(jié)果表明，超量表達(dá)CREG1顯著增加了LO2細(xì)胞對這些示蹤劑的攝取。之后，脈沖追逐（pulse-chase）實(shí)驗(yàn)和功能喪失分析（loss-of-function analysis）的結(jié)果表明CREG1可以促進(jìn)大胞吞作用，格行蛋白依賴性內(nèi)吞作用和內(nèi)吞運(yùn)輸。

超量表達(dá)CREG1增加了內(nèi)吞運(yùn)輸以及CREG1與溶酶體標(biāo)記的共定位。這表明，CREG1可能促進(jìn)溶酶體生成。免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人干細(xì)胞中超量表達(dá)CREG1增加了LAMP1、ATP6V1H、CTSC、preproCTSD和CTSD的表達(dá)。溶酶體蛋白的上調(diào)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后，因?yàn)樗鼈兊?/span>mRNA轉(zhuǎn)錄本沒有增加。在AML12小鼠肝細(xì)胞中，敲除CREG1降低了LAMP1、ATP6V1H、CTSD和HEXA的表達(dá)，相比之下，這些蛋白質(zhì)的mRNA轉(zhuǎn)錄本要么沒有變化，要么略有增加。為了進(jìn)一步證實(shí)CREG1在體內(nèi)對溶酶體生物發(fā)生的調(diào)控，作者使用CRISPR技術(shù)通過在1-3外顯子側(cè)插入loxP位點(diǎn)得到CREG1 floxed小鼠。進(jìn)一步與UBC-Cre/ERT2小鼠（在8周齡時(shí)腹腔注射他莫昔酚刪除Creg1基因）雜交得到Creg1^fl/fl小鼠，將creg1敲除小鼠與野生型C57BL/6小鼠雜交，得到了Creg1 ^+/-小鼠。檢測creg1^-/-小鼠肝臟溶酶體蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)敲除CREG1降低了ATP6V1H、CTSC、CTSD和HEXA的表達(dá)。這些結(jié)果說明CREG1在溶酶體生物發(fā)生中起著重要作用。

核內(nèi)體的酸化對于內(nèi)化配體-受體復(fù)合物的解離和受體的再循環(huán)是必不可少的。作者發(fā)現(xiàn)CREG1可以促進(jìn)了內(nèi)吞-溶酶體室的酸化。溶酶體的主要功能是通過內(nèi)吞/吞噬作用消化細(xì)胞外吞噬的物質(zhì)，以及通過自噬消化細(xì)胞不需要的成分。為了確定CREG1誘導(dǎo)的溶酶體生物發(fā)生和酸化是否對溶酶體功能有影響，作者通過免疫染色對SQSTM1/p62 (sequestosome 1)進(jìn)行了氨基酸剝奪誘導(dǎo)自噬分析。LO2細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中檢測到高水平的SQSTM1呈點(diǎn)狀分布，而超量表達(dá)CREG1導(dǎo)致SQSTM1聚集物的顯著減少。氯喹抑制了溶酶體活性，阻斷了SQSTM1的減少。這表明，CREG1超量表達(dá)誘導(dǎo)的SQSTM1減少是由于溶酶體降解加速所致。綜上所述，超量表達(dá)CREG1主要通過增強(qiáng)溶酶體介導(dǎo)的降解來促進(jìn)自噬。功能獲得和丟失分析顯示，CREG1促進(jìn)溶酶體生物發(fā)生、酸化和降解，從而加速自噬通量。這些作用可能是由增強(qiáng)的內(nèi)吞運(yùn)輸介導(dǎo)的。

細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬（autophagy）是一個(gè)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬在機(jī)體的生理和病理過程中都能見到，其所起的作用是正面還是負(fù)面的尚未完全闡明，例如：細(xì)胞在饑餓過程中會啟動自噬，但是也與許多病理過程相關(guān)比，如發(fā)育、分化、神經(jīng)退行性疾病、應(yīng)激、感染以及癌癥。mTOR 激酶是誘導(dǎo)自噬的重要調(diào)節(jié)分子，通過mTOR激活A(yù)kt 和 MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可以抑制自噬，而激活A(yù)MPK 和 p53 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)則會促進(jìn)自噬。在哺乳動物細(xì)胞中ULK1、ULK2、UKL3最為mTOR的下游，會激活自噬發(fā)生的重要復(fù)合體PI3K 形成，促進(jìn)LC3-I 和LC3-II形成，調(diào)控自噬的發(fā)生。綜合目前的研究發(fā)現(xiàn)，LC3-II、Beclin-1和P62均可作為自噬發(fā)生檢測的標(biāo)志物。

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